內(nèi)切酶切不開(kāi)或不*的問(wèn)題探索

　　1.質(zhì)粒問(wèn)題

　　制備不當(dāng)?shù)腄NA樣品、純度差或殘留酶切污染（抑制物）。雜蛋白存在會(huì)影響酶切，表現(xiàn)為A260/A280低于1.8；抑制物常見(jiàn)酚、乙醇、蛋白質(zhì)、EDTA、SDS、高鹽等。

　　A260/A280是在測(cè)量DNA、RNA提純后的純度的，如果有蛋白質(zhì)污染，這個(gè)比值就比較小。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在280處有吸收值。高純度的DNA、RNA這個(gè)比值應(yīng)該在1.8-2左右。

　　2.酶的問(wèn)題

　　確認(rèn)內(nèi)切酶有效（很多內(nèi)切酶雖然有過(guò)期時(shí)間，但過(guò)期后只要能夠有效酶切，可用。確認(rèn)酶切效果不好，做標(biāo)記，更換）。

　　3.buffer問(wèn)題

　　有些酶切的buffer中，添加了一些較為容易析出或溶解的成分，有時(shí)酶切的buffer沒(méi)有*融化時(shí)，buffer的濃度是不均一的。新的buffer先融化的部分，鹽離子濃度要高，使用一段時(shí)間后，融化部分的離子濃度會(huì)變低。通常，這種影響不大，但如果是使用一些對(duì)離子濃度敏感的內(nèi)切酶時(shí)就會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。

　　4.雙酶切的buffer選擇

　　確認(rèn)使用的是正確的buffer和反應(yīng)溫度。

　　5.酶切位點(diǎn)的甲基化影響

　　限制性內(nèi)切酶不能切割甲基化的識(shí)別序列。常見(jiàn)的有Xba I、Bcl I等。甲基化主要分為Dam、Dcm和CpG甲基化等。大腸桿菌等原核生物具有限制－修飾系統(tǒng)，Dam、Dcm常使DNA樣品甲基化而不被切割。如果是直接從哺乳動(dòng)物細(xì)胞中提取的DNA，則部分DNA會(huì)因CG methylase的影響而被甲基化。一些酶切位點(diǎn)被甲基化后，酶切會(huì)受影響。因此，出現(xiàn)酶切不開(kāi)或不全時(shí)需要考慮甲基化的問(wèn)題。